摘要 胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，异质性较强，具有复杂的分子特征。HER2、MSI、TMB和NTRK融合等肿瘤相关标志物及分子病理学检测革新了胃癌诊疗模式。根据患者的病理特征和基因检测结果进一步筛选靶向和免疫药物的潜在获益人群，是胃癌精准治疗的未来发展方向。高通量测序（next-generation sequencing，NGS）在胃癌诊断、治疗方案选择、预后监测中发挥着日益重要的作用。然而，国内目前对胃癌NGS的理解与应用尚有不足。中国抗癌协会胃癌专业委员会专家组基于循证医学证据制定《胃癌高通量测序临床应用中国专家共识》，旨在提高中国临床医生与患者对于胃癌NGS的认识，以指导与规范其在国内的临床应用。 概述 胃癌是指原发于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，在东亚国家和地区发病率最高，国家癌症中心发布最新数据显示，胃癌在中国发病率为28.68/100 000，在恶性肿瘤中排名第3位[1]。2015年年龄标准化的5年总生存（overall survival，OS）率仅为35.1%，疾病负担仍然较重[2]。高通量测序（next-generation sequencing，NGS）也称二代测序技术，相比于荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）、双脱氧法测序（Sanger sequencing）和聚合酶链式反应（polymeRASe chain reaction，PCR）等传统分子标志物检测方法具有明显的高通量优势，可在短时间内对数百种基因的多种变异形式进行检测。近年来，NGS检测的临床应用范围越来越广泛，中国临床肿瘤学会（CSCO）、中国抗癌协会（CACA）以及美国国立综合癌症网络（NCCN）等指南均已将NGS列为肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）、微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）、基因点突变、插入缺失、拷贝数变异及融合等标志物的检测方法之一[3-5]。此外，NGS对于胃癌病程监测、寻找潜在特异性治疗靶点等也具有重要应用价值[6]。然而，NGS检测技术流程复杂，信息量巨大，为保证临床诊疗工作的准确性和规范性，中国抗癌协会胃癌专业委员会专家组结合国内外指南共识和近期相关研究文献及数据，制定胃癌高通量测序的中国专家共识，对NGS技术在胃癌诊疗中的应用进行规范和指导，以期成为临床医生决策的重要依据。 胃癌的精准诊断和分型是规范化治疗的基础，基于NGS的分子检测能为胃癌的病理诊断提供重要的参考。本共识依据循证医学证据类别和专家组意见一致率，确定共识的推荐等级（表1），其中高级别证据来源于严谨、高质量的Meta分析或随机对照试验结果；低级别证据来源于一般质量的Meta分析、非随机对照研究、观察性研究和病例报告；专家组赞同率≥95%被视为意见高度一致；专家组赞同率在80%～95%视为意见基本一致；专家组赞同率<80%则视为存在意见分歧。 1.1 遗传性胃癌的分子诊断 胃癌多为散发性，其中5%～10%存在家族聚集现象，3%～5%存在遗传倾向[7]。遗传性胃癌为常染色体显性遗传病，主要包括3种类型：遗传性弥漫型胃癌（hereditary diffuse gastric cancer，HDGC）、胃腺癌伴近端多发息肉（gastric adenocarcinoma and proximal polyposis of the stomach，GAPPS）及家族性肠型胃癌（familial intestinal gastric cancer，FIGC）。HDGC多由抑癌基因CDH1胚系突变失活引起[8]，同时一小部分与CTNNA1、PALB2或RAD51C基因异常有关[9]。GAPPS是一种罕见的胃息肉综合征，有报道表明与APC基因外显子1B区突变相关[10]。FIGC主要依靠临床诊断，其易感基因目前尚不明确[11]。高度微卫星不稳定性/错配修复蛋白表达缺失（MSI-high/deficient mismatch repair，MSI-H/dMMR）与肿瘤患者合并林奇综合征（Lynch syndrome，LS）显著相关，需对MSI-H/dMMR的胃癌患者进行LS胚系遗传评估[12]。青少年息肉综合征（juvenile polyposis syndrome，JPS）[13]、锯齿状息肉病综合征（serrated polyposis syndrome，SPS）、波伊茨-耶格综合征（Peutz-Jeghers syndrome，PJS）[14]、遗传性乳腺-卵巢癌综合征（hereditary breast and ovarian cancer syndrome，HBOCS）[15]、家族性腺瘤性息肉病（familial adenomatous polyposis，FAP）[16]和MUYTH-相关性息肉病（MUTYH-associated polyposis，MAP）[17]等遗传疾病亦与胃癌的发生相关。遗传性胃癌筛查因素应综合考虑胃癌患者或家族史个人的因素：1）发病年龄；2）一、二级亲属的胃癌-乳腺癌家族史；3）JPS或胃肠息肉或LS家族史；4）亲属携带已知的胃癌易感基因变异[3]。遗传性胃癌相关筛查基因见表2。 共识1：对考虑遗传性胃癌的患者或具有胃癌家族史的个体，使用NGS进行遗传性肿瘤相关基因筛查，并做到具体的遗传咨询（推荐等级：Ⅲ级）。 1.2 胃癌的分子分型 胃癌目前经典的分型标准主要基于组织学，NGS尤其是全外显子组测序（whole-exome sequencing，WES）的应用在鉴定发病机制相关基因突变方面发挥关键的作用。在分子分型的研究中，TCGA分型将胃癌分为4个分子亚型：EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）阳性、MSI-H、染色体不稳定型和基因组稳定型[18]。EBV和MSI-H还可作为胃癌伴淋巴样间质这一特殊类型的鉴别诊断标志物[4]。亚洲癌症研究小组也通过基因表达谱、全基因组拷贝数变异微阵列和靶向基因测序将胃癌分为4个亚型[19]。胃癌的分子分型仍在探索中，科学的分子分型能够为指导患者风险分层和制定精准治疗方案提供参考和依据。 共识2：胃癌分子分型有助于精准诊断和后续治疗选择，需要结合病理形态、IHC和全面的NGS检测结果以明确分子分型，目前虽然临床指导意义尚有局限之处，但具有临床探索性研究的意义（推荐等级：Ⅲ级）。 NGS可评估胃癌的遗传学变异，确定治疗方案和（或）临床试验入组，特别是指导靶向和免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）等精准治疗的使用。 2.1.1 使用NGS鉴定HER2状态的必要性 HER2蛋白由原癌基因ERBB2编码，13%～22%胃癌患者出现HER2蛋白过表达或基因扩增[20]，常用的检测手段包括IHC和FISH。由于胃癌转移灶异质性较强，原发灶HER2阴性的患者，转移灶仍需检测HER2状态；对于复发性胃癌，HER2的二次活检也非常必要。美国食品药品监督管理局（FDA）批准的FoundationOne®CDx判断胃癌ERBB2扩增的标准是肿瘤中二倍体拷贝数（copy number，CN）≥5[21]。有研究证实，IHC检测胃癌HER2阳性（IHC 3+）和NGS 检测扩增具有80%的一致性（16/20）[22]，使用NGS panel MSK-IMPACT检测与IHC/FISH联合判断HER2状态的一致性高达100%（39/39）[23]。ERBB2基因扩增不能简单等价于HER2蛋白过表达，如IHC和NGS结果不一致需慎重解读，可尝试使用抗HER2靶向治疗。目前仍需前瞻性临床试验证实NGS检测HER2状态的临床价值。 共识3：推荐对所有诊断为胃癌的患者，优先通过IHC/FISH判读HER2状态，可使用NGS检测ERBB2基因扩增作为补充，有助于抗HER2靶向治疗，或者联合ICIs治疗晚期胃癌患者（推荐等级：Ⅱ级）。 2.1.2 NGS指导晚期胃癌抗HER2治疗的作用 NGS也能在HER2抑制剂的治疗决策中发挥作用，在对50例HER2阳性的食管胃腺癌患者接受一线曲妥珠单抗治疗队列的回顾性分析中发现[24]，4例NGS阴性而IHC/FISH阳性的患者疾病迅速进展，且ERBB2扩增水平前25%患者的无进展生存期（progression-free survival，PFS）显著高于其他患者。因此，由NGS定义的ERBB2扩增可能较IHC/FISH检测在预测HER2抑制剂临床响应方面更加稳定。 除曲妥珠单抗治疗后HER2阳性丢失外，基因组突变可能导致抗HER2治疗耐药[25]，而NGS是广泛检测突变的有力工具。有研究表明，包括ERBB1（EGFR）、ERBB2、EBBB3、FGFR1、NF1、KRAS、PIK3CA基因的RTK-RAS-PI3K信号通路突变与HER2靶向治疗原发耐药相关，ERBB2、ERBB4、NF1突变及CCNE1扩增与抗HER2治疗继发耐药显著相关[26]。 共识4：基于NGS检测全面评估晚期胃癌患者的ERBB2扩增状态，以及RTK-RAS-PI3K等通路耐药基因突变，有助于抗HER2靶向治疗及其他治疗方案的制定（推荐等级：Ⅲ级）。 2.2 胃癌ICIs治疗优势人群的分子特征 2.2.1 NGS判断MSI-H的方法 不同胃癌分子分型中均将MSI状态作为独立的标志物，不同研究显示MSI-H在胃癌中的发生率为7.8%～22%[27-28]。MSI除了与LS遗传筛查、胃癌伴淋巴样间质鉴别诊断及晚期患者接受ICIs疗效相关外，MSI-H的早期胃癌患者接受标准化疗可能会导致不良结局，单纯手术患者生存率提高[27]。目前国际公认使用PCR+毛细管电泳法检测5个微卫星位点进行鉴定。2022 V2版NCCN胃癌指南首次增加NGS作为检测MSI的方法之一[5]。一项利用15～2 957个微卫星标记的NGS鉴定MSI状态的研究证实，NGS诊断MSI-H具有极高的敏感性（96.4%～100%）和特异性（97.2%～100%）[29]。在一项中国胃癌人群的研究中，经IHC评估为dMMR的43例患者，与NGS判断MSI-H的结果高度一致[30]。 共识5：推荐对所有初诊的胃癌患者，优先使用IHC判断MMR，可使用PCR/NGS鉴定MSI状态（推荐等级：Ⅰ级）。 2.2.2 胃癌TMB-H的判定标准 TMB-H也是ICIs治疗获益肿瘤患者的分子标志物，与MSI-H具有显著相关性[31]。与MSI状态鉴定不同，TMB检测的“金标准”是WES[32]。胃癌患者中TMB值≤5 muts/Mb的约占66.2%，5～10 muts/Mb约11.3%，10～40 muts/Mb约19.5%，≥40 muts/Mb约3.0%[33]。一项泛癌种研究发现，TMB前20%患者接受ICIs治疗的OS更长；采用“五分位法”定义TMB-H（>8.8 muts/Mb），其中126例食管胃腺癌患者未观察到生存获益[34]。特瑞普利单抗临床试验发现，前20%的TMB-H（TMB≥12 muts/Mb）胃癌患者具有更优的客观缓解率和OS[35]。2022 V2版NCCN胃癌指南推荐使用帕博利珠单药治疗TMB截断值≥10 muts/Mb的患者[36]。通常检测的基因数目越多，NGS panel拟合的TMB值与WES的一致性越好，使用超过300个基因的大panel（覆盖率≥0.8 Mb，最好≥1.0 Mb）即可较好地评估TMB值[37]。 共识6：选择合适的NGS方法（>300个基因的panel）判断TMB-H，有助于作为医生对胃癌患者采用ICIs治疗的参考（推荐等级：Ⅱ级）。 2.2.3 胃癌ICIs治疗疗效的其他预测标志物 除MSI-H和TMB-H外，占胃癌8.8%的EBV阳性患者也可能从ICIs治疗获益。通过ISH检测EBER是EBV感染检测的“金标准”，以包含EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3和BZLF1共4个基因的panel检测EBV与EBER-ISH相比，总体准确率高达98.7%[38]。另外，有研究证实在360例胃腺癌中突变率为7.99%的POLE/POLD1变异也与ICIs治疗获益正相关，突变组PFS和OS更长[39]。 关于疗效负相关标志物，虽然在肺癌或黑色素瘤中发现B2M、JAK1/2、STK11和PTEN突变可降低免疫治疗效果，但STK11突变并不是胃癌ICIs治疗的独立预后标志物[40]。在MSS胃食管腺癌中，ICIs治疗TP53/ target=_blank class=infotextkey>P53突变患者比野生型OS更差[41]。约9%接受免疫治疗的患者存在超进展，EGFR、MDM2、MDM4、DNMT3A等基因突变与超进展相关，及时识别有助于患者治疗选择[42]。 共识7：NGS既可以检测免疫治疗正相关的标志物，也可发现负相关和超进展的分子标志物，对携带负相关/超进展突变的患者不优先推荐免疫治疗，在接受免疫治疗时应密切观察和随访，具有临床探索性研究意义（推荐等级：Ⅲ级）。 2.3 NGS在胃癌患者NTRK基因融合检测中的意义 2022年中国国家药品监督管理局（NMPA）批准拉罗替尼用于携带NTRK融合基因且不包括已知获得性耐药突变的成人和儿童实体瘤[43]。IHC可以检测TRK蛋白过表达，适合作为初筛手段[44]。2022版CSCO胃癌指南建议使用FISH或NGS进行结果验证，在IHC阳性而DNA-based NGS检测NTRK阴性时，应使用RNA-NGS方法确认[45]。NTRK检测方法学比较见表3。此外，NGS的另一大优势是对获得性耐药突变位点的检测，包括溶剂前沿位点突变、守门员突变和xDFG-motif区域突变等[46]。NGS在胃癌分子诊断中的临床实践
NGS检测标志物在胃癌精准治疗中的临床意义
共识8：可先使用IHC初筛后再使用NGS检测NTRK融合，若条件允许可同时提取组织中DNA和RNA，通过NGS并行测序直接鉴定（推荐等级：Ⅱ级）。
2.4 基于NGS检测的潜在治疗标志物
基于标志物指导胃癌精准治疗的研究一直处于探索阶段。基于IHC检测标志物的K-umbrella研究中，依据标志物的治疗方式并未较标准治疗方式更获益[47]，而改良后基于NGS检测生物标志物指导治疗的K-umbrella GC-2研究正在进行中。
氟尿嘧啶和伊立替康作为胃癌化疗方案中的常用药物，在胃癌治疗中发挥重要作用。DYPD和UGT1A1分别编码氟尿嘧啶和伊立替康的相关代谢激酶，对两类药物可疑代谢障碍患者，NGS可检测患者的遗传多态性[48-49]。
目前，NTRK酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）被NMPA和FDA在泛癌种获批适应证，2022年FDA批准针对RET激酶的TKIs用于携带RET基因融合的实体瘤患者[50]，RET融合检测方法与NTRK融合类似。另有BRAF/MEK抑制剂组合疗法被FDA批准用于既往标准治疗失败且无满意替代治疗方案的BRAF V600E突变不可切除或转移性实体瘤（结直肠癌除外）患者[51]。RET融合和BRAF V600E在胃癌中较罕见，临床可根据实际情况进行选择。
携带与ERBB2扩增互斥的FGFR2扩增的胃癌患者可能从FGFR抑制剂治疗中获益[52]。RTK通路另外的重要靶点EGFR和MET，其TKIs在Ⅲ期临床中未能展现疗效[53-54]，NGS方法可能有助于筛选合适的可从TKIs治疗中获益的胃癌患者。针对PIK3CA突变/扩增、RAS突变/扩增、ROS1融合和NRG1融合的治疗药物也在多种实体瘤中证实有效，可能是胃癌患者的潜在获益生物标志物，还需要积累更多临床数据和循证依据。
共识9：标准治疗失败的晚期转移性胃癌患者可通过NGS检测潜在标志物，如此前未进行NGS多基因检测，可考虑进行NGS检测寻找潜在治疗方案（推荐等级：Ⅲ级）。
NGS检测循环肿瘤DNA在胃癌中的潜在价值
基于NGS的循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）检测，具有无创性、可反映瘤内和转移灶异质性、动态监测疗效和复发等优势，在临床实践中应用日益广泛。
3.1 早中期可切除胃癌患者的NGS ctDNA分子残留病灶检测及复发转移监控
分子残留病灶（molecular residual disease，MRD）可通过NGS和PCR方法鉴定，而传统影像学和实验室方法不能发现，在患者进行相应治疗后检测到MRD与未来高复发风险相关[55]。《ctDNA高通量测序临床实践专家共识（2022年版）》推荐使用NGS进行MRD检测，基本技术标准可稳定检出丰度≥0.02%的ctDNA[56]。
MRD最明显的潜在临床应用是实现辅助或巩固系统治疗的个性化。临床试验CRITICS对胃癌样本行NGS检测，分别在患者入组时（基线）、术前新辅助治疗3个周期后和术后辅助治疗前共3个时间点进行检测，发现7例术前化疗响应患者未检测到ctDNA，43例患者中30例术前ctDNA分析与病理反应一致，说明术前ctDNA是病理响应的标志物；中位随访42个月后，观察到术后未检测到MRD的11例患者均生存且无复发，检测到MRD的9例患者中6例出现复发并死于转移性疾病[57]。在一项纳入46例Ⅰ～Ⅲ期胃癌患者评估MRD与胃癌术后临床结果相关性的研究中，证实所有术后检测到ctDNA的患者均经历复发，术后随访期间任何时间的ctDNA阳性均与OS更差相关（HR=7.664，95% CI：2.916～21.06）[58]。目前尚不清楚根据MRD阳性结果的治疗是否会影响患者的自然病史，且缺乏基于MRD进行个性化辅助治疗的前瞻性研究；另外，基于MRD的去强化治疗策略，也需要通过非劣效性随机试验与标准治疗进行比较验证[59]。
共识10：MRD检测具有指导个性化辅助和巩固治疗的潜在价值，目前在胃癌中仍需要前瞻性、多中心、大样本临床试验证明其检测价值，建议临床医生在检测前就NGS ctDNA检测的局限性和费用情况与患者进行充分沟通（推荐等级：Ⅲ级）。
3.2 晚期胃癌基于NGS液态活检的分型
当晚期患者肿瘤组织不可用、存在样本采集技术性挑战、采取紧急治疗的患者延迟获取组织活检可能限制治疗选择时，ctDNA检测是合适的选择。有研究表明，ctDNA检测ERBB2扩增与组织检测HER2阳性一致性为91.07%[60]。2022版CSCO胃癌指南建议对无法取得活检组织的患者，通过NGS检测ctDNA ERBB2扩增是可能有效的补充手段[3]。
尽管多数胃癌靶向治疗的方案选择须依据组织分子检测结果，但ctDNA液态检测的优势为其带来了临床应用价值。一项纳入260例晚期胃食管腺癌患者的研究证实，ctDNA分型可显著缩短筛查时间（11天 vs. 33天）、提高试验入选率（9.5% vs. 4.1%），且不影响治疗效果[61]。在原发病灶和转移病灶不一致的病变中，NGS ctDNA测序可分析出原发灶中未测到的基因扩增，转移组织和ctDNA检测一致性达87.5%[62]。有研究表明，NGS ctDNA可与组织NGS检测互补，得出的预测和预后信息较为重要，能指导抗HER2治疗在胃-食管交界部癌中的应用[63]。
共识11：对无法取得活检组织的患者，可通过NGS ctDNA进行基因分型，检测ERBB2扩增作为参考（推荐等级：Ⅱ级）。
3.3 晚期胃癌疗效和耐药性的动态评估
由于ctDNA具有半衰期短和无创重复采样的特性，因此可用于治疗期间监测疾病进展，且相较于临床/影像检查能更早识别治疗响应[64]。一项纳入17例食管胃腺癌的研究中，于第2、4、8周及之后每8周直至进展检测ctDNA和肿瘤标志物，证实了4周化疗后ctDNA的降低可能比癌胚抗原更有效地预测患者的临床获益（敏感性60% vs. 24%）[65]。在一项对接受了ICIs治疗和ctDNA监测的泛癌种队列（包含48例胃食管腺癌）的分析中，证实ctDNA动力学可以预测免疫治疗的长期获益情况[66]。可通过检测EBBB2 ctDNA扩增的改变来发现胃癌HER2靶向治疗的耐药性[67]，此外，也有研究证实在抗HER2治疗耐药的12例患者中，ctDNA相比基线出现新的突变[68]。另有研究表明，ctDNA水平变化是鉴别免疫治疗真性或假性进展的潜在标志物[69]。
共识12：动态监测ctDNA水平有助于评估晚期胃癌治疗效果和耐药性，但缺乏足够证据表明依据NGS ctDNA结果采取干预会改善预后，需要随机性临床试验验证其临床效用（推荐等级：Ⅲ级）。
NGS在胃癌病程管理中的临床应用见表4。
NGS报告解读规范及实验检测规范
4.1 NGS报告出具和解读逻辑
包含全面而准确的分子诊断信息、并被科学解读的检测报告是胃癌NGS临床应用的前提和基础。
4.1.1 NGS报告的内容和要点
NGS在胃癌患者诊疗中有重要临床应用价值，而其报告信息庞杂，给解读带来一定困难。因此亟需明确报告的内容和要点，将NGS检测结果转化为临床医生可读取并用于指导临床决策的结构化报告。
一份全面准确的NGS的报告应包含：1）样本信息：样本类型、采集部位和时间、送检时间、样本编号和样本质控。2）基本信息：胃癌受检者的姓名、性别、年龄、组织病理诊断和临床指征等。3）检测项目：检测范围、试剂、仪器、方法和检测限等。4）实验室信息：实验室名称、操作人员、报告审核人员和联系方式。5）检测结果和解读：对检出基因组的变异进行解读，解析变异的诊断和预后价值，特别是根据证据等级评估变异-药物敏感性[70]，胚系突变则以美国医学遗传学学院指南为标准[71]。6）标明实验室内验证结果，阐明检测的局限性和不确定性，提供下一步检测建议。
4.1.2 基于报告的临床决策流程
结构化的NGS报告，需要通过合理的逻辑进行科学解读。对于NGS阳性报告，需要根据不同的样本类型进行解读。未纳入白细胞/癌旁组织对照而仅有胃癌组织样本，则无法鉴别胚系突变。对于组织和血液检出的变异，按照变异等级分层判断变异的临床意义，尤其是检出高丰度胃癌驱动突变如ERBB2扩增，指导靶向治疗意义明确；如果检出变异丰度较低，则需要考虑漏检亚克隆可能性；检出多个驱动突变的，需要明确证据优先级排序，并分析克隆演化和耐药相关性；检出多个非胃癌高频突变的，则可在证据等级基础上考虑TMB。目前MRD具有肿瘤先验和肿瘤未知两个路线，两种策略的选择仍在探索阶段，报告解读模式未能达成共识。需注意，应避免 “查字典”式的使用报告中突变信息，根据变异等级解读出的药物推荐不等同于直接的临床用药方案。对已经进行多次基因检测的患者，需要在明确首次检测结果的基础上，综合判断多次检测报告的临床意义。对于阴性报告，可能原因包括所选择panel不适合或样本不合格等。临床医生需结合情况具体分析，提取有价值的信息，再根据具体情况考虑是否重新取样或检测。
组建由肿瘤、病理、分子生物学和生物信息学等多领域专家组成的分子肿瘤专家委员会（MTB），能更好地解读NGS检测结果。胃癌由于其复杂的异质性和治疗的多样性，使得多学科会诊（multi-disciplinary treatment，MDT）联合MTB的NGS报告解读需求尤为迫切。在MDT+MTB的逐步推广下，基于精准的NGS检测和全面的临床讨论作出的治疗决策将为胃癌患者带来更多获益。
共识13：建议对NGS检测获得的结果进行识别和分类注释，并匹配证据等级，形成可视化的循证报告。报告解读可采取多学科精准诊疗（MDT+MTB）模式，临床医生应结合NGS报告和患者具体临床表现、病理和影像结果等制定完善的治疗方案（推荐等级：Ⅱ级）。
4.2 NGS样本的处理和应用原则
NGS可选组织样本和液态样本，不同类型样本有各自的处理要求和应用场景。
4.2.1 组织样本的处理和应用
新鲜组织样本的处理：手术采集组织≥50 mg；穿刺活检样本≥2条，长度≥1 cm。新鲜组织可提取到高质量的核酸，完成采集后，于30 min内将组织样本用PBS或生理盐水洗净，浸泡在DNA/RNA保存液或中性福尔马林溶液。可使用冷冻切片染色评估样本的肿瘤细胞含量，含量不足可通过标记肿瘤区域富集。
FFPE样本处理：按照病理规范要求收集，开展NGS检测前通过苏木精-伊红染色评估，肿瘤细胞含量≥20%，最佳含量>30%。若肿瘤细胞含量<20%，则需通过圈片富集肿瘤细胞，并在报告中提示样本局限性。为了获得足够的核酸量，一般石蜡切检规格建议厚度5～10 μm，每片>5 mm×5 mm。
离体样本需规范化固定，从源头把控样本质量，应首选肿瘤组织标本检测，优先检测关键诊疗标志物，包括ERBB2扩增、MSI、TMB和NTRK融合（表4）。
共识14：胃癌患者进行基因检测，肿瘤组织需先进行病理评估。当可检组织有限，序贯检测单一标志物或使用有限的分子诊断组合可能导致样本迅速耗竭时， 可使用合适的NGS技术同时识别ERBB2扩增、MSI、TMB和NTRK融合（推荐等级：Ⅱ级）。
4.2.2 血液样本的处理和应用
血液/血浆样本在取样时应采用专用的ctDNA保存管采血，采血后轻柔颠倒8～10次，避免凝血或溶血发生。建议采集10～20 mL全血，血样应尽快送至检验实验室并分离血浆，提取游离DNA后，保存于-80℃冰箱中，并避免反复冻融。
晚期胃癌患者组织不足时，ctDNA检测可用于分型和疗效预测。对于ctDNA MRD检测，采集类型和时间应依据临床实际，选择是否收集组织样本作为基线资料，术后MRD检测应尽量在术后1周进行，对于愈合时间较长的手术，可能需要2周或更长时间。检测过程中需要警惕接近NGS检测下限（0.1%～0.5%）的基因变异，可能无法判断临床是否获益，尤其对于组织，而对于ctDNA则可适当放宽该标准。
共识15：在组织达不到NGS检测要求时，高质量深度测序的血液ctDNA是重要补充手段（推荐等级：Ⅲ级）。
4.3 NGS的实验质控
NGS的质量控制流程应包含流程中的所有环节，全流程“从源从严”质控，保证结果真实有效：1）实验室应明确样本的运送及接收规范，建立标准作业程序（standard operating procedure，SOP）。2）实验室应建立核酸提取SOP，并在建立文库前对DNA质量进行评估。3）文库构建时，需采用已验证过的建库试剂，按照标准判定文库构建是否合格。4）开展胃癌NGS检测应优先选择NMPA批准的测序平台。5）实验室应确定下机数据量，并对测序深度和阳性判断值进行评估。6）NGS的生信分析应包括原始数据质控、数据过滤质控、序列比对质控、样本测序质控，以及变异的鉴定分析、注释和筛选。7）实验室应根据胃癌的突变类型，选择合适的算法，提高对变异检出的效能。国内外胃癌人群存在分子突变差异[72]，国际通用数据库对中国人群疾病分析缺乏精准性，建议实验室建立本地变异数据库。8）实验室出具报告时需再次核对患者、疾病和样本检测信息等。9）实验室应建立验证实验SOP，NGS的性能验证指标包括但不限于精密度、准确性、敏感性、特异性和可报告范围等。另外，需对存疑样本进行正交验证，方法可以包括ddPCR、Sanger、qPCR、MassArray等。10）完成报告后，实验室应在发送报告后进行报告单接收确认，确保报告单安全性和患者隐私。
共识16：NGS检测机构或中心应制定并执行完善的质量控制流程，符合分子诊断实验规范要求，列明质量标准及质量参数（推荐等级：Ⅰ级）。
4.4 NGS检测机构的选择
NGS检测实验室的总体设计与建造应按照《NGS实验室建设标准与要求》进行。聘请符合胃癌NGS检测要求的专业人员，出具报告人员应了解胃癌国内外指南共识和最新精准诊疗进展。实验室所有人员均应达到国家规定的相应资质，培训合格后方可上岗。实验室需以“工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时”为基本原则，规范实验分区，配备满足胃癌NGS检测所需求的仪器设备，优先选择NMPA批准的试剂耗材，日常检测中应保证室内质控。
进行NGS检测的机构应为资质齐全、技术实力雄厚、后续服务能力强的正规机构，需获得中国合格评定国家认可委员会（CNAS）、美国病理学会（CAP）或美国临床实验室改进法案修正案（CLIA）认证。NGS实验室应每年参加由国家卫生健康委员会临床检验中心、病理质控中心或欧洲分子基因诊断质量联盟等机构组织的室间质量评价与能力验证，保证实验室质控体系符合标准。
共识17：NGS测序应选择正规的检测机构，该机构的各项检测流程需通过CAP、CLIA或CNAS资质认证，确保检测结果准确可靠（推荐等级：Ⅰ级）。
结语与展望
本共识根据近期研究成果，在胃癌NGS检测的遗传性筛查、分子诊断、精准治疗、ctDNA液态活检的应用，以及NGS的报告和实验规范等方面进行了推荐。希望通过本共识的发布，指导中国胃癌NGS的临床实践。由于NGS在胃癌诊断、治疗和复发监测等方面仍缺乏前瞻性大样本的循证医学证据，部分内容可能存在争议。随着胃癌分子精准诊疗的进步和高质量循证依据的积累，NGS共识也需要保持更新，不断丰富和完善以规范胃癌患者的个体化诊疗。
共识编写专家委员会
专家组组长：
徐惠绵 中国医科大学附属第一医院
梁 寒 天津医科大学肿瘤医院
聂勇战 空军军医大学西京医院
王振宁 中国医科大学附属第一医院
张小田 北京大学肿瘤医院
专家组成员（按姓氏笔画排列）：
马 冬 广东省人民医院
王旭东 吉林大学第二医院
卢瑗瑗 空军军医大学西京医院
刘凌翔 南京医科大学第一附属医院
朱志图 锦州医科大学附属第一医院
李国立 南京大学医学院附属金陵医院
沈 贤 温州医科大学附属第一医院
吴 昊 南京医科大学第一附属医院
吴平平 江苏省肿瘤医院
严志龙 宁波市第一医院
张敬东 辽宁省肿瘤医院
张 俊 上海交通大学医学院附属瑞金医院
张 星 江苏先声医学诊断有限公司
张 阳 大连医科大学附属第二医院
周 桥 四川大学华西医院
姜艳芳 吉林大学第一医院
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唐 勇 新疆医科大学附属肿瘤医院
程向东 浙江省肿瘤医院
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赫丽杰 辽宁省人民医院
执笔人：
李 凯 中国医科大学附属第一医院
曲秀娟 中国医科大学附属第一医院
白 莉 中国人民解放军总医院
陆元志 暨南大学附属第一医院
